树突状细胞-Walker-256融合瘤苗的构建及对肝癌大鼠抗肿瘤作用的研究

摘要：目的 研究树突状细胞(DC)、Walker-256肿瘤细胞融合的肿瘤疫苗对大鼠肝癌模型的抗肿瘤免疫作用及其抑制肿瘤新生血管的机理.方法 利用50%聚乙二醇(PEG)法诱导Walker256肿瘤细胞与成熟DC融合,制备DC-Walker-256融合瘤苗.取6～8周龄健康雄性SD大鼠32只,建立种植性肝癌模型,随机分为4组:融合瘤苗组、混合培养组、单纯DC组和空白对照组,每组8只.建模后第7和14天各组大鼠分别皮下注射融合瘤苗、DC-Walker-256和DC混合培养细胞、单纯DC和PBS.第28天处死各组大鼠,观察各组大鼠肝脏肿瘤情况;收集大鼠脾脏制备淋巴细胞,酶联免疫斑点试验(ELISPOT)法检测大鼠抗原特异性的细胞毒T淋巴细胞(CTL),采用免疫组织化学检测肿瘤微血管密度(MVD)计数以及血管内皮生长因子-A(VEGF-A)、血管生成素(ANG)-1和ANG-2的蛋白表达.结果 融合瘤苗组、混合培养组、单纯DC组和空白对照组大鼠术后28 d分别存活8、5、6和3只;除融合瘤苗组外,其他3组大鼠均不同程度存在活动少、食纳差、皮毛光泽差及腹水形成.除融合瘤苗组2只大鼠无明显肉眼肿瘤形成外,其余存活大鼠均可见肿瘤形成.①大鼠肝脏肿瘤重量:融合瘤苗组[(32.4±9.2)g]明显轻于混合培养组[(67.3±5.1)g,P=0.031]、单纯DC组[(75.0±8.3)g,P=0.019]和空白对照组[(86.6±10.5)g,P=0.0083.②CTL每孔斑点数:融合瘤苗组[(404.51±25.34)个]明显多于其他3组[混合培养组:(214.54±21.45)个,P=0.019;单纯DC组:(226.52±32.55)个,P=0.025;空白对照组:(56.54±16.21)个,P=0.001].③MVD计数:融合瘤苗组为(24.12±2.32)个/HP,明显低于混合培养组[(40.34±1.29)个/HP,P=0.025]、单纯DC组[(42.36±3.16)个/HP,P=0.035]和空白对照组[(56.48±5.16)个/HP,P=0.006];混合培养组和单纯DC组大鼠MVD计数均少于空白对照组(P=0.040和P=0.043),而混合培养组与单纯DC组之间差异无统计学意义(P=0.165).④VEGF-A蛋白表达阳性率:融合瘤苗组为23.2%,明显低于混合培养组(42.5%,P=0.031)、单纯DC组(61.3%,P=0.019)和空白对照组(89.6%,P=0.003);混合培养组和单纯DC组均低于空白对照组(P=0.027和P=0.038),而混合培养组与单纯DC组之间差异则无统计学意义(P=0.089).⑤ANG-1蛋白表达阳性率:融合瘤苗组大鼠为43.2%,与混合培养组(46.3%,P=0.292)、单纯DC组(51.3%,P=0.183)和空白对照组(49.6%,P=0.179)比较差异无统计学意义;混合培养组与单纯DC组(P=0.242)、混合培养组与空白对照组(P=0.347)、单纯DC组和空白对照组(P=0.182)之间也无统计学意义.⑥ANG-2蛋白表达阳性率在融合瘤苗组为19.2%,明显低于混合培养组(62.3%,P=0.007)、单纯DC组(67.3%,P=0.005)和空白对照组(71.6%,P=0.004);混合培养组与单纯DC组(P=0.634)、混合培养组与空白对照组(P=0.483)、单纯DC组和空白对照组(P=0.379)之间差异则无统计学意义.结论 融合瘤苗能够诱导CD8+ CTL建立有效的抗肿瘤免疫,同时下调VEGF和ANG-2的水平,抑制肿瘤新生血管,从而达到治疗肿瘤的目的.