AMPK通过调控mTOR/Nix信号通路参与小鼠肝缺血-再灌注损伤

摘要：目的 探讨腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)在肝脏缺血-再灌注损伤(hepatic ischemia-reperfusion injury,HIRI)中的作用机制.方法 ①分组.将42只小鼠随机分为假手术组(Sham组)、4个时点缺血-再灌注(IR)组(2、6、12及24 h)、Compound C组及Compound C+雷帕霉素(Rapa)组,每组6只小鼠.CompoundC组:腹腔注射CompoundC (25 mg/kg)lh后,建模.Compound C+Rapa组:腹腔注射Rapa(1mg/kg)和Compound C (25 mg/kg)1 h后,建模.4个时点IR组、Compound C组和Compound C+Rapa组小鼠制备HIRI模型.Sham组小鼠仅行开腹、游离第一肝门以及关腹操作.②IR佳时点筛选.检测Sham组和4个时点IR组小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)浓度,取肝组织行HE染色观察肝组织的病理学改变,并采用蛋白印迹法检测小鼠肝组织中自噬、凋亡相关蛋白的表达.综合血生化检测结果、HE染色结果和蛋白印迹实验结果确定IR佳观察时点.③AMPK机制研究.取IR-12h组、CompoundC组(建模后12h)和Compound C+Rapa组(建模后12h)小鼠肝脏组织,行免疫组化染色观察增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,行罗丹明123染色观察线粒体损伤情况,行蛋白印迹实验检测自噬、凋亡相关蛋白的表达,行末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL法)检测肝脏细胞的凋亡情况.结果 ①IR后12h为佳观察时点.与IR-12h组比较,Sham组,IR-2、6及24h组的ALT和AST浓度均较低(P＜0.05);HE染色结果示IR-12h组小鼠的肝组织结构破坏为严重;蛋白印迹实验结果示,与IR-12h组比较,Sham组,IR-2、6及24h组的AMPKα、磷酸化型腺苷酸活化蛋白激酶α(p-AMPKα)、Nip3样蛋白X(Nix)及BCL-2同源的水溶性相关蛋白(Bax)的表达水平,以及自噬微管相关蛋白轻链3 (LC3)Ⅱ/LC3 Ⅰ比值均较低(P＜0.05),而磷酸化型哺乳动物Rapa靶蛋白(p-mTOR)的表达水平均较高(P＜0.05).因此IR 12 h为佳观察时点.②与IR-12 h组比较,CompoundC组小鼠肝组织中PCNA的表达水平较低(P＜0.05),线粒体发光强度较弱,凋亡细胞较多;与Compound C组比较,Compound C+Rapa组小鼠肝组织中PCNA的表达水平较高(P＜0.05),线粒体发光强度较强,凋亡细胞较少.③与IR-12 h组比较,Compound C组小鼠肝组织中Nix及p-AMPKα的表达水平和LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值均降低(P＜0.05),而p-mTOR、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)及分裂型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3 (Cleaved Caspase-3)的表达水平均升高(P＜0.05);与Compound C组比较,Compound C+Rapa组小鼠肝组织中p-AMPKα和Nix的表达水平均升高(P＜0.05),而p-mTOR、Caspase-3和Cleaved Caspase-3的表达水平均降低(P＜0.05).结论 在小鼠HIRI过程中,AMPK通过m-TOR/Nix通路调节线粒体自噬和凋亡.